迫切需要临床开发用于软组织修复的炎症调节聚合物支架，以减少术后并发症。然而，用于疝修复的护理软组织修复网的当前标准是高度发炎的，并且引发失调的炎症过程，引起内脏粘连和术后并发症。最近，美国贝勒医学院CrystalS.Shin和GhanashyamAcharya教授，莱斯大学AparnaAdumbumkulath教授，以及克里斯特斯健康研究所StevenA.Curley教授团队提出了用于软组织修复的炎症调节生物材料支架（bioscaffold）的开发。相关论文3DBioprintedInflammationModulatingPolymerScaffoldsforSoftTissueRepair发表在《AdvancedMaterials》上。生物支架的设计基于以下思想：如果通过外科植入生物支架将过量的促炎细胞因子隔离在损伤部位，则可以调节炎症反应，并最大程度地减少内脏粘连的形成和术后并发症。生物支架是通过原位磷酸盐交联的聚乙烯醇聚合物的3D生物打印制成的。在大鼠腹疝模型中评估生物支架的体内功效。体内对组织的促炎细胞因子表达分析和组织病理学分析已证实，生物支架可充当炎症陷阱并捕获植入部位分泌的促炎细胞因子，并有效调节局部炎症，而无需使用外源性抗炎剂。该生物支架在抑制内脏粘连形成和最小化术后并发症方面非常有效。
软组织损伤是由于肌肉或结缔组织的弱化或破坏而发生的。最常见的软组织损伤包括疝。腹壁薄弱，有缺陷和受伤会导致疝。这会造成腹部内容物可能突出的缺陷。疝的最常见类型是切开，腹股沟，股骨，脐带和食管裂孔疝。疝的修复是通过外科植入义眼网来牢固地支撑和加固受损的腹壁并促进愈合过程（图1A，B）。每年，要进行超过40万例切口疝修补手术，美国医疗保健费用约为亿美元。人工疝网植入物是使用合成，生物和涂层材料开发的。尽管具有特定的优势，但这些网状植入物在最大限度地减少潜在的不良术后并发症方面不是非常有效。用网状植入物进行的手术疝修复大多是由于网状植入物内脏粘连，硬化和网状收缩而失败。内脏粘连是从胃，肠或结肠的下层浆膜形成的纤维组织，其附着在植入的网片上。这些粘附主要由胶原蛋白和成纤维细胞组成，它们生长在网状物上并粘附在附近的组织，神经和器官上。随着粘连的增加，网孔缩小，疤痕组织变硬，从而形成坚硬的纤维状团块，可能导致慢性疼痛，肠梗阻，肠瘘，不育，生活质量差和手术疝修复失败。为了移除失败的疝网，需要进行复杂的手术，其中必须将网从膀胱，胃，肠，结肠或主要血管上剥离，这可能对临床结果产生不利影响。为了最小化粘附形成，移植物收缩和异物反应，已经开发了可吸收的和生物的网片。然而，由于非常高的疝复发率，这些网片并不是很有效。外科网片植入引起不良并发症的原因是慢性炎症反应，网片组织整合不良，材料的快速降解，网片的表面化学和拓扑化学设计。
图1生物支架设计和手术疝修复。A）示意图，显示内部器官通过腹疝突出。B）外科植入网以加强腹壁。A，B）经贝勒医学院许可复制。C–E）示意图描述了生物支架调节腹膜粘连形成的机制。C）对腹膜间皮层的损害，其中分泌了带正电的促炎细胞因子。D）通过连接腹膜层和内脏器官的间皮形成粘附。E）植入带负电的生物支架以在手术创伤后从受损的腹膜捕获带正电的促炎细胞因子。
生物支架的设计基于以下思想：如果通过外科手术植入带负电荷的生物支架将过量的带正电荷的促炎细胞因子隔离在腹膜损伤部位，则可以调节炎症反应，并使内脏粘连的形成最小化。生物支架充当炎性细胞因子的“陷阱”，并捕获在手术疝修复部位分泌的促炎细胞因子，从而有效地调节局部炎症（图1C–E）。该生物支架薄且柔韧，其拉伸强度被编程为与正常的完整腹壁的拉伸强度相匹配。这项研究还证明了合理设计和控制生物支架上的表面化学和电荷，以调节炎症并限制粘连形成，而不会损害大鼠腹疝模型的愈合过程。生物支架可防止术后内脏粘连的形成，而无需外源性抗炎疗法。用于外科手术植入的生物支架旨在增强软组织的愈合过程，并减少术后发病率，慢性疼痛和植入物相关的并发症。
通过3D打印制造了具有原位磷酸酯交联的聚乙烯醇聚合物（X-PVA）的生物支架。XPVA是由PVA与三偏磷酸钠（STMP）在室温下反应合成的（图2A）。PVA是形成水凝胶的合成聚合物，通常用作药物赋形剂和制造药物输送系统。STMP是用于交联多糖的无*环状三磷酸酯。STMP通过磷酸酯基交联多糖的羟基。通过3D打印制作生物支架涉及PVA和STMP溶液的逐层打印以及原位交联，因此，可以通过优化阵列设计，生产线厚度和打印层数，以可重复的方式严格控制厚度和弹性模量。通过修改打印参数（例如针规，针压，阵列设计和打印的层数），可以优化3D打印的生物支架的机械性能。对于本研究中的生物支架制造，组织使用了内径为0.15毫米，长度为6.35毫米，针压为0.17兆帕，针筒体积为10毫升的32号针头。打印4、6、8、10和12层生物支架，并测试其弹性模量。基于这些研究，将八层的生物支架用于体内实验。
图2.生物支架的制造和表征。A）PVA与STMP交联反应形成磷酸盐交联的X-PVA。B）3D打印的生物支架。C–E）3D打印的生物支架展示了其柔韧性。F）使用10％PVA和15％STMP溶液制作了十层生物支架-10，八层生物支架-8和六层生物支架-6的弹性模量的曲线图。G）经过数次应力应变循环后，生物支架8的缝合线保持能力一致。H）描绘包含不同磷酸盐交联密度的生物支架的ζ电势的图。使用10％PVA和15％STMP溶液制造高度交联的Bioscaffold-A，使用10％PVA和10％STMP溶液制造中等交联的Bioscaffold-B，使用10％PVA和7.5％STMP制造低交联的Bioscaffold-C解。
生物支架柔软，柔韧，并且在手术植入过程中易于操作（图2B–E）。使用这种方法，通过添加3D打印策略制造了具有一系列机械强度的纤维生物支架。健康的个体在跳跃或咳嗽时产生的最大腹腔内压力约为20kPa，腹壁的弹性模量约为80kPa。在这项研究中，通过添加3D打印制造了三个6、8和10个打印层的生物支架，它们分别是：生物支架-6，生物支架8和生物支架10。生物支架6的弹性模量约为，生物支架8的弹性模量为，生物支架10的弹性模量为kPa（图2F）。在图2F中，该图说明了样品的弹性，曲线的终点是观察断裂点的位置。这项研究表明，生物支架8可以在不失败的情况下保持缝合线高达kPa，这是健康人体内最大腹腔内压力（20kPa）的约5倍（图2G）。
图3生物支架充当炎性细胞因子捕获表面。A）示意图，显示了生物支架捕获炎性细胞因子的体外策略。B–G）明场和荧光的叠加以及荧光共聚焦显微镜图像表明：B）在生物支架表面上不存在细胞因子的情况下，抗体珠不结合；C）与吸附在生物支架上的TNF-α结合的TNF-α抗体珠；D）与结合于生物支架表面的IL-1α结合的IL-1α抗体珠;E）与吸附在生物支架表面的IL-6结合的IL-6抗体珠;F）与MIP-1α结合的MIP-1α抗体珠吸附在生物支架表面上;G）与吸附在生物支架表面上的VEGF结合的VEGF抗体珠。
如图3A所示，通过基于珠子的生物测定法评估了生物支架捕获带正电的促炎细胞因子的能力。将一小块生物支架（5mm×5mm）在细胞因子溶液中孵育，然后用水冲洗。然后将经细胞因子处理的生物支架与细胞因子抗体偶联的荧光珠一起温育，然后彻底冲洗。然后对生物支架进行荧光成像。这项研究表明促炎细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6与生物支架表面结合。图3B–G显示了明场的叠加，荧光图像显示了细胞因子结合的生物支架表面。为了清楚起见，荧光图像显示在叠加图像旁边。在生物支架表面上不存在细胞因子的情况下，抗体珠不与生物支架结合（图3B）。TNF-α抗体偶联的珠选择性结合至生物支架表面吸附的TNF-α（图3C）。同样，IL-1α，IL-6和MIP-1α抗体偶联的磁珠也选择性结合至生物支架表面吸附的相应IL-1α，IL-6，MIP-1α和血管内皮生长因子（VEGF）（图3D–G）。这项研究证实了生物支架捕获炎性细胞因子的内在能力。
图4生物支架在小鼠皮肤伤口模型中从伤口组织中捕获促炎细胞因子。A–C）呈现未经处理的皮肤伤口（A），植入PROLENE网格的皮肤伤口（B）和植入生物支架的伤口的照片（用镊子提起生物支架的边缘以显示存在皮肤生物支架在皮肤伤口中）（C）。D）细胞因子浓度的RT-PCR分析表明，与PROLENE筛网相比，生物支架具有很高的捕获促炎细胞因子的功效。
在疝修补手术患者的腹膜液中，检测到促炎性细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α浓度增加，从而形成内脏粘连。因此，降低疝修补部位中这些促炎细胞因子的浓度对调节局部炎症和内脏粘连形成很重要。为了测试生物支架捕获促炎细胞因子的功效，将生物支架植入小鼠皮肤伤口模型中，并与PROLENE网眼进行了比较（图4A–C）。对于本研究，将雌性Balb/c小鼠（10周大）随机分为两组，并通过活检穿孔器创建直径1cm的皮肤伤口。第一组植入PROLENE网片（直径1厘米），第二组植入生物支架（直径1厘米）。植入5天后，取回生物支架和PROLENE网并均质化以将捕获的细胞因子提取到溶液中。提取的细胞因子溶液经过实时聚合酶链反应（RT-PCR）分析。这项研究证实了与PROLENE筛网相比，生物支架能够以高浓度捕获促炎细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α（图4D）。
图5生物支架在大鼠腹疝模型中的手术植入后预防内脏粘连形成的功效。A）PROLENE网片，B，C）植入2周和4周后取回PROLENE网片，表明形成广泛的内脏粘连。D）生物支架，E＆F）植入2和4周后回收的生物支架。G）植入2周后，PROLENE网孔的H＆E染色横截面。黑色箭头指向植入网的位置，红色箭头指向内脏粘连。H）植入2周后，生物支架的H＆E染色横截面。黑色箭头指示植入的生物支架的位置，蓝色箭头指示不存在内脏粘连和新的腹膜层形成。I，J）2到4周后H＆E染色的生物支架外植体横截面的高倍放大图像，表明在生物支架表面上形成了腹膜层。
为了评估这种新型生物支架在预防粘连形成中的功效，将其植入大鼠腹疝模型中。为了比较生物支架的功效，将商用聚丙烯网（PROLENE）用作对照，因为它在外科疝修复中具有广泛的临床应用。在本研究中，将Sprague-Dawley大鼠随机分为两组，第一组植入PROLENE网孔，第二组植入生物支架。在实验过程中，动物没有不适，行为改变或食物和水摄入减少的现象。在2周和4周的时间点进行尸检后，从大鼠中取出生物支架，并检查它们上的内脏粘连形成。在2周和4周的时间点，PROLENE网孔触发了极高水平的腹膜内粘连形成网孔和腹腔内（图5A–C）。植入后两周，PROLENE网孔完全被粘连物覆盖，缝合线和网孔不可见（图5B）。在第4周的时间点，PROLENE网眼除了被牢固的粘连完全覆盖之外，还紧密附着在下面的网膜，肝和肠上。这些粘连广泛并密集新生血管。需要进行尖锐的解剖才能从PROLENE网片上剥离这些粘连（图5C）。对于从大鼠回收的生物支架，在第2周和第4周的时间点均未观察到粘连形成。生物支架和缝合线的边缘清晰可见（图5D–F）。
图7生物支架表面电荷对粘附形成的影响。A）PROLENE网孔，B）生物支架，C）中性生物支架，D）聚赖氨酸涂覆的带正电的生物支架，E）纤连蛋白涂覆的生物支架，和F）明胶涂覆的生物支架。G）RT-PCR分析促炎细胞因子的表达水平。
为了评估表面电荷对粘附形成的影响，制造了三种不同表面电荷的生物支架：1）带负电荷表面的生物支架，2）带中性表面的生物支架，和3）带正电荷表面的生物支架。按照逐层3D打印方法制备，由于磷酸基团的存在，生物支架的表面带负电荷。通过将材料浸泡在HCl中（1m，30分钟）以将带负电荷的磷酸基团转化为磷酸基团，来制备中性生物支架。将带正电的生物支架浸入聚赖氨酸氢溴酸盐溶液（0.1mgmL-1，1h）中以在其表面上形成聚赖氨酸单层。需要注意的重要一点是表面电荷的变化也改变了表面化学性质。为了评估表面电荷对术后粘连形成的影响，将这些生物支架植入大鼠腹疝模型中，并与PROLENE网孔进行比较（图7A）。带负电的生物支架在其表面上未引起任何粘附形成，并且缝合线清晰可见（图7B）。在中性生物支架的情况下，观察到广泛的腹膜粘连形成，可能是由于表面上的酸基（图7C）。在带正电的聚赖氨酸涂层生物支架的情况下，再次观察到广泛的纤维化粘连形成（图7D）。在这一点上，很好奇看到纤连蛋白和明胶包被的生物支架对粘连形成的影响。纤连蛋白是带正电的ECM糖蛋白，在早期伤口愈合和组织修复中起关键作用。纤连蛋白和明胶包被的生物支架也可在2周内触发粘连形成，尽管不如聚l-赖氨酸包被的生物支架那么严重（图7E，F）。为了在分子水平上评估表面电荷对炎症和内脏黏附形成的影响，分析了植入部位周围组织的促炎细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β的表达水平。β和VEGF，并通过RT-PCR分析与PROLENE网格进行比较。这项研究表明，在中性和带正电的生物支架中，促炎细胞因子的表达水平与在PROLENE网中观察到的水平高。另一方面，带负电荷的生物支架引起的炎症反应可忽略不计，促炎细胞因子的表达水平极低（图7G）。综上所述，带正电和中性的生物支架引发了广泛的粘连形成，这与PROLENE筛网所见的一样重要（图7A，C，D）。这项研究清楚地证明了生物支架表面负电荷在预防术后内脏粘连形成中的重要性。通过吸附单层带正电的聚赖氨酸或纤连蛋白，生物支架表面电荷的轻度变化会产生更高水平的炎症细胞因子表达，从而形成覆盖生物支架的血管化粘连，并将植入的材料连接至肝脏和肠。这些结果证实了生物支架设计中表面化学和表面电荷的重要考虑。
参考文献：
doi.org/10.2/adma.
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