北京中科白癜风医院价格 https://jbk.familydoctor.com.cn/bjbdfyy_zx/英国制药巨头阿斯利康（AstraZeneca）公司在genOway的PD-1/CTLA-4双免疫检查点人源化小鼠（赛业生物已与genOway达成战略合作伙伴关系并引进该小鼠）上测试了一款新型的同时靶向PD-1和CTLA-4的单价双特异性抗体MEDI，研究结果发表在了CancerDiscovery上。
背景
免疫检查点疗法是近来肿瘤治疗的热门领域，其中，靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4的抑制剂都已获批上市，并取得了显著成果。此外，PD-1和CTLA-4抑制剂的联用也在包括黑色素瘤、肾癌、非小细胞肺癌在内的多种肿瘤中表现出了显著增强的抗肿瘤效果。但其中，CTLA-4抑制剂的免疫相关不良事件（(immune-relatedadverseevents，irAEs）也一直是个令人头疼的问题，包括常见的胃肠道*性、皮肤*性和肝脏*性等。为了解决这个问题，AstraZeneca公司研发了一款同时靶向PD-1和CTLA-4的单价双特异性抗体MEDI。MEDI是一种能优先抑制PD-1+T细胞上CTLA-4的新型免疫抑制剂。
与传统的PD-1/CTLA-4双抗不同，MEDI能引发对PD-1的快速内化和降解，并能优先定位和聚积在肿瘤部位。MEDI目前正处于phaseI阶段(NCT)，并在两名晚期实体瘤患者中观测到了部分缓解（partialresponse,PR）。
此外，值得一提的是，AstraZeneca有一款最早由辉瑞（Pfizer）公司研发是anti-CTLA-4全人源化单克隆抗体Tremelimumab。但由于Tremelimumab在临床试验中一直表现不佳，直至目前为止，还没有获批治疗任何癌症。AstraZeneca也在尝试将Tremelimumab与其他免疫检查点抑制剂药物联用，例如，Tremelimumab与Imfinzi（anti-PD-L1）联用来治疗非小细胞肺癌（III期NEPTUNE试验失败）、晚期膀胱癌（III期DANUBE试验失败）、肝细胞癌（III期HIMALAYA试验进行中）等癌症。AstraZeneca将Tremelimumab和一个anti-PD-1mAb进行组合与改造，构建了MEDI。
CTLA-4在多种实体瘤TILs中的PD-1+T细胞上表达富集
研究人员分析了来自4种肿瘤的44个肿瘤样本：结直肠癌（CRC）、非小细胞肺癌（NSCLC）、肾细胞癌（RCC）和黑色素瘤（Melanoma），发现在所有类型的肿瘤中均可发现PD-1+CTLA-4+的CD4+和CD8+T细胞，并且CTLA-4的表达在PD-1+T细胞上富集。此外，研究人员还发现，肿瘤反应性CD8+T细胞的标志物CD39在PD-1+CTLA-4+肿瘤浸润性淋巴细胞(TumorInfiltratingLymphocytes,TILs)上表达富集。在随后对例头颈部鳞状细胞癌（SCCHN），NSCLC和尿路上皮细胞癌（UCC）样本进行的影像融合（co-registration）分析显示，80%SCCHN、84%鳞状细胞NSCLC（NSCLC-Sq）、89%腺癌NSCLC（NSCLC-Ad）和90%尿路上皮癌（UCC）中都存在PD-1+CTLA-4+TILs。
MEDI的结构设计与特征
AstraZeneca将anti-CTLA-4的Tremelimumab和一个anti-PD-1mAb进行组合，构成了MEDI的基本结构。MEDI中人gamma-1重链恒定区也进行了改造（LF、LE和PS）以降低Fc介导的免疫效应功能。此外，与亲本抗体一致，MEDI只对小鼠PD-1有低亲和力，而和小鼠CTLA-4无交叉反应。
图1.MEDI的结构示意图[1]
效价对PD-1的抑制作用影响很小，而对CTLA-4影响较大
研究人员使用了双细胞荧光素酶报告实验（two-cellluciferasereporterassay）和PBMC实验来研究抗体效价（valence）对PD-1和CTLA-4抑制作用的影响。双细胞荧光素酶报告实验结果显示，与二价anti-PD-1mAb相比，单价anti-PD-1抗体MEDI或mvPD-1的半最大效应浓度（EC50）分别升高了3.5倍和3.8倍（图2A-B）；与二价anti-CTLA-4mAb相比，单价anti-CTLA-4抗体MEDI或mvCTLA-4的EC50则分别升高了14.9倍and13.3倍（图2C-D）。
在PBMC实验中，研究人员也观察到了类似的现象。mvPD-1诱导PBMC增加2倍IL2分泌量的最低有效浓度（MEC）只比anti-PD-1mAb高1.14倍；而mvCTLA-4的MEC则比anti-CTLA-4mAb高8.1倍。这些结果说明valence对PD-1的抑制作用影响很小，而对CTLA-4的抑制作用影响较大，因此，MEDI与CTLA-4的结合能力在PD-1T细胞上可能会显著下降。
图2.单价（Monovalent）降低了MEDI对CTLA-4的效力，但对PD-1的抑制作用影响很小[1]
MEDI能优先抑制PD-1+细胞上的CTLA-4
在靶向两个不同的细胞表面受体的双抗中，双抗会倾向优先与表达密度高的受体结合。因此，双抗与表达密度高的受体的结合率将只取决于对应单价臂对该受体的内在亲和力，而第二个单价臂与表达密度低的受体的结合则会被限制在一个相当于抗体长度的半径范围中。在这个范围里，第二个单价臂对表达密度低的受体的结合力明显增强，研究人员将这个现象称为“cooperativebinding”（图3A）。已知在PD-1+CTLA-4+双阳性T细胞中，PD-1在细胞膜上的表达密度比CTLA-4高，因此，MEDI会优先与PD-1结合。并且，与只表达CTLA-4的PD-1-CTLA-4+CHO细胞相比，MEDI会优先靶向和饱和PD-1+CTLA-4+CHO细胞上的CTLA-4（图3B）。
为了探究“cooperativebinding”的效应，研究人员在活化的人PBMC中加入（block）或不加入（noblock）饱和浓度的PD-1抗体进行处理。在block组，MEDI只会与CTLA4结合；在noblock组，MEDI能发挥“cooperativebinding”效应。实验结果显示，“cooperativebinding”效应显著降低了诱导PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI浓度（93.55倍）(图3C)。这些结果说明MEDI能优先抑制PD-1+细胞上的CTLA-4。
图3.与PD-1-CTLA-4+单阳性细胞相比，MEDI优先与PD-1+CTLA-4+双阳性细胞上的CTLA-4结合[1]
MEDI介导了PD-1的内化和降解
有报道显示，细胞膜表面80%的CTLA-4会在5分钟内被快速内化（internalization），因此在任意时间点，细胞膜表面都只会有少量的CTLA-4存在。研究人员探究了MEDI及其亲本抗体在PD-1+CTLA-4+CHO细胞、人原代CD4+和CD8+T细胞中的内化能力。结果显示MEDI和只靶向CTLA-4的抗体（anti-CTLA4mAb和mvCTLA4）都能被快速内化，而只靶向PD-1的抗体（anti-PD-1mAb和mvPD-1）的内化程度非常低（图4A）。
为探究内化后PD-1和CTLA4的去向，研究人员使用了带有荧光标记的PD-1+SNAP-tag/CTLA4+CLIP-tag双阳性CHO细胞来进行追踪。实验结果显示，只有同时靶向PD-1和CTLA-4的MEDI能显著增强对细胞膜表面PD-1的降解；此外，与加入Buffer的空白对照组对比，加入靶向PD-1或CTLA-4抗体并没有显著改变CTLA4的内化（图4B）。这些结果说明MEDI通过与CTLA-4结合，介导了PD-1的内化和降解。
图4.MEDI介导了PD-1的内化和降解[1]
与单抗组合相比，MEDI优先靶向双阳性细胞上的CTLA-4
与单抗组合（anti-CTLA4mAb和anti–PD-1mAb）相比，MEDI能以低10倍和倍的浓度分别使PD-1+CTLA-4+（10:1）CHO细胞和PD-1+CTLA-4+（40:1）CHO细胞上的CTLA-4饱和（图5A-B）。此外，MEDI饱和PD-1的能力与单抗组合相比没有明显区别（图5B）。接下来，研究人员再次在活化PBMC上探究了MEDI的“cooperativebinding”效应。实验结果显示，与单抗组合（anti-PD-1mAb/anti-CTLA4mAb或anti-PD-1mAb/mvCTLA4mAb）相比，MEDI的“cooperativebinding”效应显著降低了诱导PBMC增加3倍IL2分泌量所需的MEDI浓度（42.33倍和96.35倍）（图5C-D）。这些结果说明与单抗组合相比，MEDI有更强的功效。
由于CTLA-4能通过在Treg上的表达来内在地和外在地调节T细胞活化，研究人员将原代Treg与同种异体（allogeneic）的CD3+T细胞，以及清除了CD3+细胞的PBMC共培养，来模拟相关共刺激分子存在时，淋巴细胞的免疫反应。实验结果显示，单抗组合能克服Treg介导的对Teff的抑制作用，且与单抗组合相比，在Treg
eff比例为1:4和1
时，MEDI能使IFNγ的分泌量显著增加（图5E-G）。这些结果说明与单抗组合相比，MEDI在T细胞活化和克服Treg介导的抑制作用时有更高的活性。
图5.与单抗组合相比，MEDI优先靶向双阳性细胞上的CTLA-4[1]
MEDI在体内能优先定位于肿瘤部位并抑制肿瘤生长
由于MEDI与小鼠PD-1和CTLA-4缺乏交叉反应，研究人员使用了一款表达人PD-1和CTLA-4蛋白（C57BL/6N-Pdcd1tm1(huPDCD1-ICP11)GenoCtla4tm1(huCTLA4-ICP13)Geno）的转基因小鼠来进行体内实验。赛业已引进该PD-1/CTLA-4双免疫检查点人源化小鼠。实验结果显示，在携带小鼠纤维肉瘤MCA的hPD-1/hCTLA-4小鼠中，与传统的anti-CTLA4和isotypemAb相比，MEDI显著聚积在肿瘤部位；MEDI与传统的anti-PD-1mAb在肿瘤部位的聚积程度相似（图6A-D）。这些结果说明MEDI在肿瘤部位的聚积依赖于与肿瘤表面PD-1的结合。同时，这也说明对比anti-CTLA4mAb，MEDI能更有效地阻断肿瘤微环境中的CTLA-4。
在MCA荷瘤模型中，MEDI也显示出了强烈的，剂量依赖性的抗肿瘤活性：当注射剂量为10mg/kg时，MCA在超过60%的小鼠中完全清除了肿瘤（图6E）。此外，与anti-PD-1和anti-CTLA4mAb对比，单抗组合并没有显著提高荷瘤小鼠生存率，而MEDI功效显著（图6F）。而且，将人类病*特异性T细胞注射到携带人病*肽转导的OE21肿瘤的NSG小鼠中后，MEDI显著抑制了肿瘤生长（图6G）。这些结果说明与anti-CTLA4mAb相比，MEDI在体内能优先定位于肿瘤部位;而与单抗组合相比，MEDI有更强的抗肿瘤活性。
图6.MEDI在体内能优先定位于肿瘤部位并抑制肿瘤生长[1]
MEDI在晚期实体瘤中被证明有抗肿瘤活性
目前，MEDI正在进行一项针对晚期实体瘤的评估(NCT)，这也是MEDI在人体内的首次试验。MEDI在两名患者体内实现了部分缓解。其中，一名已经历五次化疗失败的61岁胃腺癌患者的肿瘤缩小了60％（图7A）；另一名从未经过治疗的51岁肾透明细胞癌患者的肿瘤缩小了68％（图7B）。目前，两名患者的无进展（progression-free）生存期已分别有80周和24周，且*性可控。
图7.MEDI在晚期实体瘤中有抗肿瘤活性[1]
总结
AstraZeneca这款同时靶向PD-1和CTLA-4的单价双抗MEDI在体外和体内实验中均显示出了显著的抗肿瘤活性。MEDI利用“cooperativebinding”，在靶向PD-1+T细胞的同时，提高了anti-CTLA-4单臂对CTLA-4的结合力，且能优先抑制PD-1+细胞上的CTLA-4。此外，MEDI融合了anti-CTLA-4和anti-PD-1的优势，能引发对PD-1的快速内化，并能优先定位在肿瘤部位。这些都显示出了PD-1/CTLA-4双抗的独特优势。
目前，多家公司在PD-1/CTLA-4双抗上也均有布局，产品包括中山康方（Akesobio）已进入phaseIb/II的AK、康宁杰瑞（Alphamab）已进入phaseII的KN、齐鲁制药（QiluPharmaceutical）已进入phaseI的QL等。
PD-1/CTLA-4双人源化小鼠助力肿瘤研究
品系背景：C57BL/6N
品系构建策略：
PD-1/CTLA-4双免疫检查点人源化小鼠模型（hPD-1/hCTLA-4）由hPD-1小鼠和hCTLA-4小鼠杂交得到。
品系说明：
■hPD-1和hCTLA-4在小鼠体内具有正常的生理表达和调节模式。
■PD1和CTLA-4胞外域人源化，利于hPD-1和hCTLA-4靶向药物的识别。
■保留小鼠PD-1和CTLA-4胞内域，保证正常的胞内信号转导。
■小鼠靶基因不表达，避免交叉反应。
小鼠的免疫系统功能健全。
研究应用：
本模型可用于评估hPD-1和/或hCTLA-4靶向药物在免疫健全小鼠体内的药效及安全性：
可以与人源肿瘤细胞系MC38-hPD-L1联用，构建同源肿瘤模型，以测试靶向人PD-1和人PD-L1的联合疗法的疗效。
模型验证：
PD-1和CTLA-4表达检测
图1.hPD-1和hCTLA-4在hPD-1/hCTLA-4小鼠中的表达模式与mPD-1和mCTLA-4在野生型小鼠中的表达模式一致。
用αCD3/αCD29抗体激活从野生型小鼠和hPD-1/hCTLA-4小鼠中分离的脾细胞。在hPD-1/hCTLA-4小鼠中，传统CD4+T细胞表达hPD-1和hCTLA-4；在野生型小鼠中，传统CD4+T细胞表达mPD-1和mCTLA-4。
图2.hPD-1和hCTLA-4在肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中的表达情况。
在hPD-1/hCTLA-4小鼠和野生型小鼠体内接种MCA小鼠纤维肉瘤细胞，并分析TILs上鼠源和人源PD-1以及CTLA-4在的表达情况。
